CO-IP实验_江苏艾菱菲生物科技有限公司

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CO-IP实验

实验原理

当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质A的抗体免疫沉淀A，那么与A在体内结合的蛋白质B也能沉淀下来。最终通过蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）进行检测。

实验流程

1.培养实验所需细胞

2.外源性CO-IP需要转染外源质粒

3.细胞裂解（常用RIPA并添加PMSF等酶抑制剂）

4.免疫沉淀反应

①磁珠预处理（protein A/G或HA等标签磁珠）

②目标抗体与磁珠结合（一般抗体使用浓度为10-50ug/mL）

③抗原沉淀反应（含有抗体的磁珠与细胞裂解液结合）

④抗原洗脱（变性和非变性两种）

⑤WB检测及结果分析

实验注意事项

1. 磁珠使用前应充分振荡均匀。

2. 选择特异性较强的抗体进行免疫沉淀反应。

3. 目的蛋白与互作蛋白不能表达量太低

4. 在合适的实验条件下操作，防止实验数据不稳定

5. 使用对照抗体：单克隆抗体：正常小鼠的IgG或另一类单抗；兔多克隆抗体：正常兔IgG

6. 细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质——蛋白质相互作用，多采用非离子变性剂（NP40 或Triton X-100）。细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的蛋白酶抑制剂PMSF。

CO-IP实验效果

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