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聚焦前沿技术与研究进展，分享艾菱菲生物在科研创新、
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突破：成功构建自发形成纠结的阿尔茨海默病 iPSC 活体神经元模型

　　导语

　　Tau 蛋白主要负责稳定神经元内的微管网络。在人类 MAPT(Tau蛋白)基因的转录过程中，由于第10号外显子(Exon10)的可变剪接(Alternative splicing)，会生成多种异构体：3R Tau：不包含第 10 号外显子的转录本生成3R Tau(含3个微管结合重复序列);3R Tau：包含该外显子的则生成4R Tau(含4个重复序列)。

　　研究人员长期以来一直受到一个问题的困扰：虽然我们能够通过诱导多能干细胞(iPSC)在实验室中培养出人类神经元，但这些神经元总是停留在“胎儿态”。这意味着它们主要表达3R异构体的Tau蛋白，而无法真实模拟成年阿尔茨海默病(AD)大脑中3R和4RTau 共同纠结 的复杂病理。

　　来自慕尼黑大学(LMU)Dominik Paquet实验室的最新研究，发表在Science Translational Medicine上(Alzforum 重点报道)，通过scarless CRISPR-Cas9基因编辑技术，成功解决了这个难题。

　　01核心突破：让神经元“一夜成年”

　　在健康的成年人大脑中，Tau 蛋白维持着3R和4R两种异构体的平衡。然而，实验室培养的普通iPSC神经元却始终停留在“胎儿态”，主要表达3R异构体，导致它们无法真实反映成年阿尔茨海默病(AD)中3R+4R共同纠结的特征。

　　研究人员(Angelika Dannert)在人类诱导多能干细胞(iPSC)衍生的皮层神经元中，通过结合 CRISPR-Cas9 与 PiggyBac 转座子系统，成功对tau基因进行了精细调控。

　　

图1.3R到4R。 CRISPR编辑与PiggyBac选择转座子的结合确保了表达3R：4R tau的iPSC来源神经元富集。通过基因编辑技术，研究者强制 iPSC 神经元跳过发育阶段，直接表达成年比例的 Tau 蛋白异构体

 

　　第一步切除与嵌入(正向筛选)：首先使用CRISPR-Cas9定向移除外显子10与11之间的整个内含子(包括负责剪接的调控元件)，迫使该拷贝持续产生 4R tau。随后在该切口处嵌入一个 PiggyBac 转座子，其中包含两个关键的筛选基因。利用嘌呤霉素(puromycin)基因进行正向筛选：将嘌呤霉素加入培养基后，未成功切除内含子并嵌入转座子的细胞会全部死亡，从而淘汰掉未编辑成功的细胞。

　　第二步转座子转座切除与纯化(负向筛选)：在培养体系中施加TK酶底物FIAU，依赖其在残留转座子细胞中代谢产生的细胞毒性效应，特异性清除未发生切出的阴性细胞群。得益于PiggyBac转座系统特有的“精确整合与无痕切出”机制，最终存活的耐受克隆实现了真正意义上的“无痕”编辑——宿主基因组中不留存任何CRISPR元件、转座子外源序列或重组疤痕，编辑精度达到了单碱基对级别。

　　第三步基因型鉴定与分子表型验证：通过设计针对3R和4R剪接异构体的特异性引物进行两轮扩增与PCR鉴定，最终证实了目标等位基因的成功构建，证实该细胞株成功实现了3R与4RTau蛋白平衡表达的预期分子表型。

　　02“PLSF”神经元：自发形成的“幽灵缠结”

　　为了在实验室培养的神经元中诱导类似阿尔茨海默病(AD)的Tau蛋白病理纤维缠结，研究人员进一步将P301L和S320F致病突变分别引入了Tau蛋白的4R等位基因的外显子10和11中(这两种突变均可导致额颞叶痴呆并伴随Tau蛋白病理)，并将引入突变的细胞命名为PLSFs，成功让神经元在无需过表达的情况下自发形成病理性 tau 蛋白。

　　随时间推移，4R PLSF杂合子细胞展现出极强的tau蛋白聚集诱导能力，并表现出与人类阿尔茨海默病(AD)患者大脑高度一致的病理特征：包括错误折叠、寡聚化、超磷酸化及不溶性tau蛋白的积累。电子显微镜及多种特异性抗体、染料的全面检测证实，这些细胞内首次形成了填满整个胞体的大型聚集纤维，攻克了以往模型表型不明显的难题。

　　

图2.随着时间推移，4R PLSF-het会积累高磷酸化(AT8)、纤维化(PHF-1)和不可溶性(K9JA)tau。荧光显微镜下可见，PLSF 神经元在培养过程中自发产生了高度磷酸化的 Tau 蛋白纤维。

 

　　03该模型在靶点发现与 CRO 管线中的转化价值

　　这套系统一经发表便引起工业界的高度关注，主要原因在于其提供了高度标准化的体外活细胞药效评价平台：

　　病理标志物的高度一致性：模型中自发产生的Tau纤维，能够与人类AD大脑组织中经典的构象特异性、寡聚化及超磷酸化抗体(如 MC-1, ALZ50, PHF-1, AT8)发生强结合。

　　复刻完整的细胞毒性级联反应：细胞不仅出现了突触密度下降和核膜破裂，甚至在细胞凋亡后遗留下了临床病理切片中经典的“幽灵缠结(Ghost tangles)”，且证实了 Tau 聚集体在神经元之间的空间级联传播能力。

　　药理学验证闭环：该模型内部的纤维能够结合临床级Tau PET影像示踪剂(PI-2620)。当在培养体系中引入小分子聚集抑制剂(Anle138b)时，成功阻断了纤维的生长和播种能力，证明其完全具备高通量药物筛选和靶点确证的实操可行性。

　　

 

　　图3.类抗震颤纤维。电子显微镜显示，4R PLSF纯合细胞的纤维形成了连接AT8(顶部)和PHF-1(下方)的纤维。

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