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【避坑指南】小鼠基因型鉴定总翻车？看懂这篇，轻松搞定小鼠鉴定！

鼠尾鉴定是一种常用的遗传学实验方法，用于确定实验鼠的基因型。基因型鉴定在基因工程小鼠应用中不可或缺。

 

DNA的提取→PCR扩增→琼脂凝胶电泳的检测→数据处理（胶图对比，基因型确定）

| 快速提取组织基因组DNA一步法抽提实验步骤--适用普通PCR鉴定

 

实验方法：  

 

① 样品取材：

 

10-50mg（小鼠一周龄即可取材，鼠尾长约2~5mm，鼠耳约3mm x 3mm，脚趾1-3枚，其他组织称重；非一周龄长度和面积相应缩小）。

 

 

注意事项:

  • 本方法只适用于新鲜取材的组织，组织离体后室温放置不得超过1小时（暂不裂解的样品需立即冻在-80℃），确保提取的基因组DNA不被降解；）
  • 对采样器具进行充分的清洗和消毒，以确保采样器具不会污染样品。

② 提DNA模板：

 

     裂解液，蛋白酶K，无水乙醇，75%DEPC无水乙醇，DEPC水,水浴锅先调到55℃，超净台提前照紫外，离心机；   

 

③ PCR：

 

2×Magic Green Taq SuperMix，引物，DEPC水，DNA样品，PCR8联管（平盖），PCR仪。

 

④ 电泳跑胶：

 

高纯度低电渗琼脂糖，核酸染料，1XTAE溶液，制胶模具，梳子，大小合适的DNAmarker，电泳仪，成像仪等实验需求相关物品。     

 

⑤ 实验方法：    

 

① 每个样品加入300ul裂解液+5ul PK，55°C消化过夜（不少于4h）裂解液配置如下图：    

 

1M Tris HCL(PH=8.0)

10 ml

0.5M EDTA

4 ml

1M NaCL

400ml

10%SDS

100ml

Add MilliQ to 1000 ml

 

    

② 乙醇沉淀：加入600ul（双倍体积）-20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒，直到可以清楚的看见絮状沉淀，离心12000rpm，5min，弃上清；

     

③ 加1ml 75%DEPC无水乙醇，离心12000rpm，5min；     

 

④ 晾干：离心后，吸出上层液体。放在超净台上风干30-60min至完全晾干，此时沉淀变透明，提取的DNA质量佳；     

 

⑤ 加入50ul DEPC水，使用上下振摇的方式充分溶解DNA；     

 

⑥ 取基因组DNA溶液3.0 μl，跑1.5%琼脂糖凝胶电泳，检测DNA提取质量；  

 

⑦ 收集的DNA可用于下游的PCR等分子生物学实验，长期存放，请置于-20℃，以防DNA降解。

     

⑥ 普通PCR反应体系  

 

 

需要设置阳性对照（如有，采用阳性小鼠样本对照，排除假阴性），野生对照（采用野生型或杂合子大、小鼠样本对照）和无模板空白对照（采用DNase Free Water代替模板DNA，排除PCR体系污染）。

 

⑦ 普通PCR反应条件

 


 

  • 请根据引物Tm值设置退火温度，一般设置成低于引物Tm值3-5℃即可；   
  • 如引物Tm值≥72℃，可删除退火步骤，直接进行后续的延伸步骤(两步法PCR)； 
  • 如果需要，推荐通过建立温度梯度寻找引物与模板结合的最适温度；
  • 若发现扩增特异性差，可适当提高退火温度;    
  • 退火温度和延伸时间会因不同品牌的PCR试剂有所区别，建议参考采购试剂说明书或咨询试剂供应商.    

⑧ PCR产物电泳检测或产物测序检测    

 

 

 


 

配置凝胶：根据PCR产物条带预期大小，配置1%~4%的琼脂糖凝胶，将1g~4g琼脂糖溶于100ml TAE缓冲液，微波炉加热至琼脂糖完全融化，加入10μL核酸染料（EB替代物），倒入电泳模板中，并插入梳子，待冷凝后使用；02
加样：向琼脂糖凝胶胶孔中加入适量的PCR产物，并根据目标条带大小加入合适DNA marker；03
跑胶：电泳仪设置120V电压，跑20-30min；04
成像：使用凝胶成像系统观察、拍摄照片；05
编辑胶图：根据条带判定基因型；   
06、对于普通电泳无法分离的项目，比如SNP项目，对PCR产物进一步采取Sanger测序，根据测序图谱比对分析判定基因型；

07、出具基因型鉴定报告。  

 

虽然这个工作很基础，但真的常常会遇到问题，并不是几个字——鼠尾 DNA PCR——就简单搞定了。究其原因往往在于你不曾注意的细节哦。以下总结了三个常见问题及解决方法↓

 

 

⑨ 报告说明    

 

 基因型的符号无统一的规定，更多是源自于使用者的习惯。

 

 

 

例：APP/PS1鼠基因型鉴定

 

 

Q除了实验室新引入小鼠外，还有什么情况需要进行基因型鉴定？

 

繁殖配对前

 

对亲本进行基因型鉴定，可以确保其基因型正确，防止源头错误导致子代混乱，提高繁育效率和实验结果的可靠性。

 

子代小鼠

如果亲本（如杂合子互配）后代基因型多样，需对子代进行基因型鉴定，通过鉴定筛选符合实验要求的特定基因型小鼠，确保实验的顺利进行。

 

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