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聚焦前沿技术与研究进展，分享艾菱菲生物在科研创新、
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J Exp Med（二）：Bulk CRISPR筛选平台——从T细胞到全免疫系统的功能解析

本篇聚焦于Bulk CRISPR筛选的最新技术进展，包括新型编辑工具、体内筛选策略，以及在T细胞之外的免疫细胞类型中的应用扩展。

 

在进入技术细节之前，先明确Bulk的含义。Bulk CRISPR筛选是指：将携带不同gRNA的细胞混合在一起进行培养或体内实验，通过群体水平的表型选择（如细胞增殖、存活、表面标志物表达）来鉴定功能性基因。

 

与单细胞筛选相比，Bulk筛选的优势在于：

  • 通量高：可覆盖全基因组（~20,000个基因）；
  • 成本低：不需要昂贵的单细胞测序；
  • 技术成熟：实验流程相对标准化。

 

其核心局限在于：只能捕捉群体平均效应，无法区分细胞亚群的差异响应。但这并不妨碍Bulk筛选作为发现候选基因的强大第一步。新型CRISPR工具


CRISPRi/a：从敲除到精细调控

传统CRISPR KO通过引入双链断裂来破坏基因功能，而CRISPRi（干扰）和CRISPRa（激活）使用催化失活的dCas9，在不切割DNA的情况下精确调控基因表达。这种调控方式在免疫细胞研究中具有重要意义：

 

01、可以研究必需基因（KO会导致细胞死亡）；

02、可以模拟部分功能丧失（更接近药物抑制的效果）；

03、可以发现正调控因子（CRISPRa增益功能筛选）。

 

关键突破：Schmidt等人（2022）通过优化高滴度慢病毒生产方案，成功在原代人T细胞中实现了CRISPRi/a筛选，鉴定了细胞因子产生的调控因子。另一项研究使用来自金黄色葡萄球菌的更紧凑dCas9变体（SadCas9），可被AAV包装递送，克服了化脓性链球菌来源dCas9体积过大的限制（McCutcheon等，2023）。

 

此外，催化失活gRNA（dgRNA）被用于Cas9表达的T细胞中，实现了高通量增益功能筛选，发现了增强T细胞效应功能的因子（Ye等，2022）。

 


ORF过表达与定点敲入文库

除CRISPRa外，大规模开放阅读框（ORF）文库和模块化敲入（KI）文库为增益功能筛选提供了新维度：

 

｜ORF过表达筛选的代表性发现：

Legut等（2022）在T细胞中过表达约12,000个条形码化人类ORF，意外发现淋巴毒素-β受体（LTβR）。一个通常在淋巴细胞中缺失的受体——能强力驱动T细胞的转录和表观基因组重塑，增强效应功能。

 

｜模块化KI筛选的代表性发现：

Blaeschke等（2023）开发了模块化池化KI筛选平台，同时筛选100个转录因子和129个表面受体，在临床相关的TCR/CAR基因位点进行组合筛选。发现TFAP4和BATF的联合敲入能显著增强T细胞适应性。

 

关键洞见：增益功能筛选与丧失功能筛选互补，前者更适合发现驱动因子，后者更适合发现刹车因子。两者结合才能全面理解免疫调控网络。

 


碱基编辑与先导编辑：精准突变扫描

碱基编辑（Base Editing）允许在不引入双链断裂的情况下进行精确的单碱基替换，这在临床应用中具有重要的安全优势：

 

01、在人T细胞中，碱基编辑可实现多基因同时删除，同时最大限度降低染色体易位风险（Diorio等，2022）

02、Schmidt等（2024）对385个基因的蛋白编码区进行碱基编辑筛选，揭示了调控T细胞激活和细胞因子产生的特定蛋白结构域和氨基酸残基

 

先导编辑（Prime Editing）则提供了更精确的编辑能力：Yan等（2024）将先导编辑蛋白PE7与RNA结合蛋白La的RNA结合域融合，显著提高了人T细胞中的先导编辑效率。

 

这些精准编辑工具正在为体内功能筛选奠定基础，例如在小鼠模型中引入体细胞突变（Katti等，2024；Ely等，2024）。


RNA编辑：Cas13d的新维度

与DNA靶向CRISPR不同，Cas13d靶向RNA。虽然有报道T细胞在识别Cas13d后会产生促炎细胞因子（Tang等，2022），但在不改变基因组的情况下实现转录组扰动依然有巨大优势：

01、无DNA断裂，理论上更安全；

02、Tieu等（2024）利用多重效应gRNA阵列筛选平台（MEGA），通过CRISPR/Cas13d发现了T细胞功能的配对调控因子。 体内CRISPR筛选：释放生理相关性

 

上述新型底层编辑工具的成熟，不仅提升了体外机制研究的维度，更为走向真实的体内生理环境奠定了技术基础。

 

体外筛选的结果往往难以直接转化为体内生物学，因为体内微环境的复杂性（免疫细胞间的相互作用、组织特异性信号、代谢环境等）会深刻影响基因功能。体内CRISPR筛选因此成为连接基础发现与临床应用的关键桥梁。

 


体内筛选的挑战

体内筛选面临的核心挑战：

 


T细胞体内筛选的成功案例

Cas9敲入小鼠的开发（Chu等，2016；Platt等，2014）是体内筛选的关键基础设施。结合过继转移模型（将抗原特异性T细胞转移到受体小鼠，再通过抗原刺激诱导强烈扩增），研究者已在CD8⁺ T细胞中系统鉴定了：

肿瘤浸润T细胞的积累和抗肿瘤活性调控因子（Baxter等，2023；Belk等，2022；Chen等，2021；Dong等，2019等）
CD4⁺ T细胞分化调控因子（Fu等，2021；Huang等，2022；Sugiura等，2022）
 T细胞迁移调控因子（Kendirli等，2023）

最新进展：Liu等（2025，预印本）在原代人T细胞中实现了体内全基因组CRISPR筛选，通过使用过表达CD3 scFv的肿瘤细胞来促进人T细胞在免疫缺陷小鼠中的高效扩增和回收，实现了高细胞覆盖度的全基因组筛选。


超越T细胞：NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞

     体内CRISPR筛选正在扩展到其他免疫细胞类型：

｜NK细胞：

基因组规模的体外CRISPR筛选已在原代人NK细胞中鉴定了增强抗肿瘤效力的靶点（Biederstadt等，2025），体内CRISPR筛选发现CALHM2是调控CAR-NK细胞抗肿瘤活性的关键遗传检查点（Peng等，2024a）。

｜树突状细胞：

全基因组体内CRISPR筛选（骨髓来源DC转移到肿瘤中）揭示了PDE5是调控DC迁移、增强抗肿瘤功能的关键调控因子（Tang等，2025a）。

｜巨噬细胞：

靶向细胞因子信号通路的体内CRISPR筛选，在多发性硬化症小鼠模型中发现了调控巨噬细胞迁移和极化的基因（de la Rosa等，2026）。


直接体内递送：CHIME和iMAP系统

对于难以体外操作的免疫细胞类型，直接体内CRISPR递送提供了新途径：

| CHIME（嵌合免疫编辑）系统：

  • 使用Cas9表达小鼠的骨髓造血干细胞，通过骨髓移植实现对先天和适应性免疫细胞谱系的基因删除；
  • 已鉴定肿瘤浸润Treg细胞的主调控因子（Obradovic等，2023）。

| X-CHIME扩展平台：

  • L-CHIME：谱系特异性基因删除；
  • I-CHIME：可诱导的时序性基因扰动；
  • 进一步扩展了原始CHIME策略的应用范围（LaFleur等，2024）。

| iMAP（可诱导嵌合动物扰动）系统：

  • 简化了gRNA制备和递送步骤；
  • 允许在稳态条件下同时评估多个基因扰动（Liu等，2022）。03 关键发现的生物学意义

通过这些Bulk CRISPR筛选，研究者已经积累了大量关于免疫调控的重要发现：

 

01 T细胞激活与功能

  •  RASA2：负调控T细胞增殖，其缺失增强抗原敏感性和长期功能（Carnevale等，2022）；
  • CD5、SOCS1：T细胞增殖的负调控因子，靶向这些基因可增强效应功能；
  • TFAP4+BATF组合：联合敲入显著增强T细胞适应性。

02 代谢与营养信号

多项体内筛选揭示了mTORC1信号、溶酶体和线粒体节点在T细胞命运决定中的核心作用（Long等，2021；Huang等，2021；Raynor等，2024）。

 

03 表观遗传调控

  • SWI/SNF染色质重塑复合物（BAF和PBAF）差异调控耗竭CD8⁺ T细胞的表观遗传转变（Baxter等，2023）；
  • cBAF复合物组分和MYC在CD8⁺ T细胞命运早期协同作用（Guo等，2022）。术选择的实践指南

 

面对如此多样的CRISPR工具，如何选择适合自己研究问题的方法？

① 明确研究目标：筛选/验证/机制 /治疗?

② 考虑基因类型：编码基因/非编码RNA/剪接变体?

③ 评估实验体系:  体外/类器官/动物/临床样本?

 

选择最合适的CRISPR工具组合，提升研究效率和生物学可信度!

在几年的发展种，Bulk CRISPR筛选经历了从单一KO筛选到多模态扰动的深刻转变。新型编辑工具（碱基编辑、先导编辑、RNA编辑）、增益功能筛选策略（CRISPRa、ORF文库、KI文库），以及体内筛选系统（CHIME、iMAP）的涌现，使得研究者能够以前所未有的精度和广度解析免疫调控网络。

 

然而，Bulk筛选无法区分细胞亚群的差异响应的固有局限，促使研究者开发了更强大的单细胞CRISPR筛选技术。这将是我们下一篇的主题。

 

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