文献解读 | 大鼠骨修复或有进展！脐带MSC衍生外泌体促恢复

发布时间：

2022-12-09 13:41

导读

目前骨科医生面临的一大挑战就是如何修复大型骨缺损。移植物内部新形成的微血管对骨组织工程的成功至关重要。此前，间充质干细胞（MSC）衍生的外泌体在血管发育和进展中的多个组织修复中发挥了积极作用。然而，关于MSC衍生的外泌体在修复大型骨缺损中的应用的报道却很少。

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2021年，海军医科大学长海医院团队在 ACS Appl Mater Interfaces（IF=9.229）杂志上发表了题为《Umbilical Mesenchymal Stem Cell-Derived Exosome-Encapsulated Hydrogels Accelerate Bone Repair by Enhancing Angiogenesis》的文章，研究成果表明：将脐带间充质干细胞衍生的外泌体（^uMSCEXOs）包裹在透明质酸水凝胶（HA凝胶）中，并将其与定制的纳米羟基磷灰石/聚-ε-己内酯（nHP）支架结合后，可以修复大鼠颅骨缺损。

解读文献

实验方案如下：

实验步骤

1. 复合材料支架制备及表征

通过超速离心法从uMSCs（脐带间充质干细胞）或HEK293细胞系的上清中分离和纯化外泌体，用透射电子显微镜（TEM）、NTA和WB分析对外泌体进行观察和表征。

通过¹H NMR光谱曲线对透明质酸水凝胶（HA凝胶）进行表征。HA凝胶（HA-Gel）在紫外光照射30分钟后可以模塑成任何形状。成功制备HA-Gel后，测试其保留外泌体的效果。^uMSCEXOs的释放曲线和HA-Gel的降解曲线显示出相似的趋势。此外，在PBS中浸泡20天后，约40%的外泌体仍留在HA-Gel中。

将脐带间充质干细胞衍生的外泌体（^uMSCEXOs）包裹在HA凝胶中，并将其与定制的纳米羟基磷灰石/聚-ε-己内酯（nHP）支架结合，扫描电子显微镜观察显示，三维多孔nHP支架材料呈圆柱形，直径5mm，高度1.5mm，支架内形成三维互连孔结构，孔的大小约为300μm，Gel/nHP复合材料的孔结构填充了交联水凝胶。

图1. 复合材料支架制备及表征

2. 脐带间充质干细胞衍生的外泌体促进了大鼠颅骨缺损的修复

构建大鼠颅骨缺损模型，分别使用3种不同的支架Gel/nHP、^HEK²⁹³EXOs/Gel/nHP、^uMSCEXOs/Gel/nHP修复缺损部位，4周和8周时利用micro-CT观察缺损部位的修复情况。

结果显示^uMSCEXOs/Gel/nHP组比其他三组观察到更多新形成的骨，BMD、BV/Tv、Tb.Th和Tb.N均显著高于其他三组，而其他三组之间没有观察到显著差异。更重要的是，在^uMSCEXOs/Gel/nHP组中观察到胶原向内生长且显著增加。

图2. 大鼠颅骨缺损micro-CT扫描的图像和定量分析

Masson染色显示，使用^uMSCEXOs/Gel/nHP复合材料处理的支架内形成了大量类骨基质和胶原，而其他组仅显示少量胶原纤维。

HE染色显示，与其他三组相比，^uMSCEXOs/Gel/nHP组生成并生长到nHP支架中的组织数量更多。

此外，对VEGFA、CD31、BMP-2和OCN进行免疫组织化学染色，^uMSCEXOs/Gel/nHP组的阳性细胞面积明显高于其他三个对照组，对照组之间未观察到显著差异。

图3. 术后8周植入区的组织学和免疫组织化学分析

这些影像学和组织学结果表明，^uMSCEXOs加速了临界尺寸颅骨缺损修复的过程，并进一步增强了支架内部血管的生成和成骨。

3. 脐带间充质干细胞衍生的外泌体在体外的促血管生成和促成骨作用

为了进一步确定^uMSCEXO的调节作用，研究人员评估了其对细胞增殖、迁移、小管形成、矿化以及相关血管生成/成骨蛋白或基因表达的影响，结果表明，^uMSCEXOs促进内皮祖细胞（EPCs）的增殖、迁移和血管生成分化。

图4. ^uMSCEXO在体外对内皮祖细胞的促血管生成作用

RT-PCR结果显示^uMSCEXOs/Gel组EPCs中促血管生成基因的表达水平显著上调，包括VEGFA、CD31和HIF-1α。关于体外成骨效应，ALP染色、WB分析和RT-PCR分析的结果并未表明各组之间存在统计学显著差异。根据这些实验结果，^uMSCEXOs在体外有效地促进了EPCs的血管生成，而对BMSCs的成骨作用不明显。

图5. 小管形成实验和促血管生成相关基因的表达水平

4. 脐带间充质干细胞衍生的外泌体中富含miR-21

根据最近的研究，将外泌体miRNA转移到受体细胞是解释外泌体生物学功能的一种新机制。因此，研究人员以^HEK293EXOs为对照，采用高通量测序方法分析了^uMSCEXOs中miRNA的整体表达。使用现有的GEO数据集（GSE46989）分析了uMSCs中的miRNA表达，发现^uMSCEXOs显示出一种特定的miRNA峰度特征，与^HEK293EXOs甚至uMSCs有很大不同。

在^uMSCEXOs最丰富的miRNA中，miR-21在uMSCs中高水平表达，该结果进一步通过RT-PCR得到证实。因此，miR-21是最常见的外泌体miRNA，可能被uMSCs主动分泌到外泌体中，也可能被内皮祖细胞内化并发挥重要的生物学作用。