文献解读 | 小鼠中风模型高分辨率micro-CT成像:从梗死表征到自动区域分割

发布时间：

2022-12-15 16:36

导读：

脑卒中：又称“中风”、“脑血管意外”，是一种急性脑血管疾病，由脑部血管突然破裂或因血管阻塞导致血液不能流入大脑而引起脑组织损伤的一组疾病。包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中。

缺血性中风是导致人们死亡和残疾的主要原因，也是导致痴呆的第二大原因。

脑卒中最常见的模型是大脑中动脉短暂性闭塞(tMCAO)模型。该模型可用于研究不同程度缺血损伤的机制和结果。tMCAO模型可导致纹状体永久性损伤(梗死核心)和周围皮层的半暗带特征。半暗带是大脑受中风影响时血流减少但仍能保持结构完整性的区域。

近年来，缺血半暗带受到越来越多的关注，这一区域成为当前许多治疗脑卒中策略的焦点。使用Micro-CT对动物模型进行扫描分析，可以全面完整地得到大脑内病理变化的结果。

-------------------------------------

脑卒中发病早期，半暗带是梗死体积最大的部分;如果没有再灌注，就会演变成无法恢复的脑梗塞。所以这一高度动态区域(也称为梗死周围区域)的具体定位和时间扩张、梗死核心区的分离是非常重要的。纤维水平(白质)的脑损伤的详细描述被认为是脑中风现象的重要衡量结果。

解读文献来源

啮齿类动物模型中风后的表征依赖于组织学检查：大脑切片的对比增强染色、免疫组化。

但是大脑切片可能会导致组织的严重损伤和扭曲，以及部分样本的消失和脑内3D环境的丧失。单独的组织学检查不能提供这些信息，只有3D成像技术可以。这里就要用到Micro-CT，该扫描技术具有：高空间分辨率、灵活性和临床前研究的低成本的特点。

Micro CT的主要缺点是软组织对x射线的低衰减。使用增强软组织x射线造影剂(如四氧化锇(OsO4)、碘、磷钼酸(PMA)和磷钨酸(PTA))的造影剂染色可以克服这一问题。

材料及造模方法

选用3 ~ 12月龄雄性/雌性野生型C57BL6小鼠。采用tMCAO手术方法造模：阻断颈外动脉及其分支，且阻断翼腭动脉，以切断颅外来源的侧副循环血流，从颈外动脉插入拴线，经颈内动脉到大脑前动脉，机械性阻断大脑中动脉发出处的血供。

实验结果

高分辨率Micro-CT成像可以做到大脑神经解剖区域的明确识别。

对整个小鼠大脑进行不同的软组织染色，图像数据集的获取需要3到5个小时。

从所有测试的化合物中，PTA和PMA不能染色整个大脑，似乎不能完全穿透组织(补充图1B,C)。

以碘海醇为例，尽管它能够穿透整个样本，但它不能较好地对比不同的大脑结构(补充图1A)。同时，四氧化锇(图1B)和无机碘(图3)染色的脑扫描显示高脑结构对比，分辨率为3.5-4 μ m体素，允许显微重建全脑三维体积(图1a,B -冠状、矢状和横轴位)。

图1

两种染色(四氧化锇和无机碘)在Micro-CT对比下十分明显。如皮层(Ctx)、纹状体(CPu)、下丘脑、丘脑(TH)和海马(HP)(图1B和补充图3)。在毒性方面，无机碘也比四氧化锇有重要优势(表1)。

表1：四氧化锇与无机碘染色全脑增强对比的不同特征比较。

采用高分辨率Micro-CT在小鼠大脑上可以观察到脑卒中相关病变。小鼠大脑遭受缺血损伤后，分别用四氧化锇或无机碘进行染色。通过Micro-CT图像采集后，再用x射线投影重建数据集。

尽管图像对比度不同，四氧化锇和无机碘染色的大脑都显示出明显的缺血性损伤的影响(图1C, 2A -锇和补充图3，碘)，包括脑水肿和脑退化的中风区域。

在病变部位，再灌注后24小时，核心区和半暗带分化明显(Fig.2A-C, Suppl）

碘染色的大脑可以用于进一步的组织学处理，保留了免疫荧光协议中使用的抗体识别的结构成分(补充图2 b)。由于碘染色方案中的脱水步骤，大脑出现了一些萎缩。计算出最终脑容量为初始脑容量的三分之一(补充图2A)

相反，虽然四氧化锇染色的大脑不会发生脑萎缩，但染色过程会导致组织矿化，进一步阻止其用于免疫荧光。

图2

小鼠脑梗死病变的表征

脑卒中的治疗评估需要发现梗死体积的细微差异。通过优化对比OsO4或无机碘增强Micro-CT成像，研究者证明了该方法适用于确定缺血性病变边界，包括在再灌注后24h区分缺血核心和半暗带，可以观察到显示脑水肿(图2A和补充图3)，以及随着时间的推移，从3h到72h(补充图5)，直到7天(已测试，数据未显示)，持续对脑病变进行跟踪。