新闻动态

NEWS

平台介绍

新闻动态

联系我们

首页

文献解读 | 最新研究！通过基因编辑猪探索心肌纤维化发病机制！

发布时间：

2022-12-16 13:31

导读：

编码心肌肌球蛋白结合蛋白C (cMyBP-C)的MYBPC3基因突变，是肥厚性心肌病(HCM)最常见的病因。心肌纤维化(MF)在HCM的发生发展中起着重要作用。然而mybpc3突变体诱导MF的机制尚不明确。在本研究中，研究者使用胞嘧啶碱基编辑技术建立了R495Q突变猪模型，并在这些突变猪出生后不久观察到早发性MF。

----------------------------------

肥厚性心肌病(HCM)是一种异质性疾病，影响着不同性别、不同民族和种族的人群。HCM主要由肌节基因的常染色体显性突变引起，在普通人群中患病率约为1:500——1:200。临床表现为左室(LV)肥厚、心肌收缩过度、顺应性降低、肌纤颤紊乱、纤维化。

在过去的二十年中，大量的证据表明MYBPC3是HCM突变最频繁的基因，约占所有HCM突变的40%-50%。

心肌肌球蛋白结合蛋白C (cMyBP-C)，这是一种柔韧的棒状蛋白，是心肌肌节的关键组成部分。在MYBPC3基因缺陷的HCM患者中，90%的突变是杂合移码、无义或剪接位点突变，导致过早地出现终止密码子(ptc)和截断cMyBP-C蛋白。

心脏纤维化是大多数心肌病理的标志，治疗选择有限。心脏纤维化相关疾病的死亡率高，发病率随年龄增长而增加。心肌纤维化(MF)可以通过心肌成纤维细胞(CFs)的增殖和心肌组织中胶原蛋白的过度沉积来验证，它是HCM发病的重要标志和决定因素。

生长因子TGF-β是研究最广泛的成纤维细胞激活介质，其中TGF- β1在病理纤维化中起着至关重要的作用。除了Smad介导的途径, TGF-β1还能诱导非典型信号传导，涉及tgf β活化激酶(TAK) 1的激活，这被认为有助于病状心脏重塑。心肌过度表达构成型活性TAK1可诱导心肌肥厚和心力衰竭。

在本研究中，研究者建立了带有R495Q突变的HCM猪模型，并在这些突变仔猪出生后不久观察到严重的MF。研究者发现MYBPC3和其他几个相关的心肌基因在成纤维细胞中表达，crispr介导的成纤维细胞中MYBPC3的遗传，破坏通过NF-KB/TGF-B1/HIF-1a有氧糖酵解信号级联，促进MYBPC3被激活为肌成纤维细胞。

实验结果

MYBPC3 R495Q突变猪模型出现心肌早衰纤维化

首先，研究者通过CBE、细胞单克隆技术和Sanger测序，建立MYBPC3 R495Q突变猪胎儿成纤维细胞(PFFs)(补充图S1a)。CBE电穿孔和MYBPC3靶向sgRNA导致猪MYBPC3的第16号外显子中的CCG转化为CTG(补充图S1b)。利用R495Q杂合PFFs，通过体细胞核移植(SCNT)获得突变体猪。总共有3只代孕母猪足月分娩，6只小猪顺利分娩。

通过测序对所有仔猪进行基因分型，其中3例新生儿在靶位点携带突变。对6个最高预测的脱靶位点进行测序分析，未发现编辑(补充图S1d)。MYBPC3 R495Q突变仔猪在出生后不久就开始死亡，3只仔猪都在10天内死亡，而野生型仔猪都存活了下来。

定量RT-PCR (qRT-PCR)分析显示，与WT仔猪相比，R495Q突变猪心肌中MYBPC3的表达显著降低(图1A)。WB分析显示，R495Q突变猪心脏中cMyBP-C蛋白显著降低(图1B、C)。血清学检查显示，突变猪的高敏感性心肌肌钙蛋白T (cTNT)和I型前胶原羧基末端前肽(PICP)（分别为心肌损伤和纤维化的高敏感性标志物）在突变猪中显著升高(图1 d和e)。

图1

纤维化相关基因如a1型胶原(COL1A1)、a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)和纤维化细胞因子(TGF-B1)在突变猪心脏中的转录本和蛋白表达水平显著上调(图1A-C)。研究者还在心脏组织切片中观察到炎症浸润(补充图S1e)和异常升高的促炎细胞因子突变猪的血清样本(补充图S1f-i)。

突变猪的血清(图1F)和心肌肌肉(补充图S1j)中的乳酸浓度均显著升高。此外，石蜡切片的Masson染色显示突变猪心肌纤维化严重(图1G&H)。综上所述，这些结果表明MYBPC3 R495Q突变导致了严重的心肌纤维化和炎症的发生。

MYBPC3在心脏成纤维细胞中表达

突变猪的早发MF表型表明。MYBPC3缺陷在调节成纤维细胞转化中具有潜在作用。

研究者首先检测了MYBPC3在原代猪心脏成纤维细胞(PCF)中的表达。免疫荧光染色显示MYBPC3和肌球蛋白轻链3 (MYL3)在野生型PCFs中都很容易检测到，在成纤维细胞标志物vimentin (VIM)呈阳性(图2A)。

为了研究MYBPC3和MYL3在心脏成纤维细胞中的表达是否具有物种特异性，研究者分析了它们在原代人心脏成纤维细胞(HCF)和小鼠心脏成纤维细胞(MCF)中的表达，发现MYBPC3和MYL3都在这些细胞中表达(图2A)。

图2

此外，研究者发现MYBPC3和MYL3在NIH3T3细胞中也有表达，NIH3T3细胞是一种常用的小鼠胚胎成纤维细胞(图2A)。WB分析证实了心肌蛋白MYBPC3、MYL3和TNNT2在NIH3T3成纤维细胞和原代小鼠、猪和人心肌成纤维细胞中表达。

MYBPC3的缺失促进成纤维细胞分化

为了了解MYBPC3在成纤维细胞中的作用，研究者利用CRISPR/Cas9系统敲除NIH3T3小鼠成纤维细胞(MYBPC3- ko)中的MYBPC3基因。将靶向小鼠Mybpc3基因的2号外显子的引导RNA (gRNA)与表达cas9的质粒一起转染到NIH3T3细胞。PCR测序显示，在gRNA目标位有效生成索引，但在前5个预测脱靶位点无效。Mybpc3 - ko小鼠的成纤维细胞中Mybpc3转录本和蛋白表达被破坏。

接下来，研究者研究了Mybpc3破坏是否可以诱导成纤维细胞活化。如图3A-C，Mybpc3断裂显著增加了肌成纤维细胞标志物COL1A1和a-SMA的转录和蛋白表达，这些数据表明，Mybpc3的破坏可诱导成纤维细胞的激活。

图3

MYBPC3的缺失可以增强成纤维细胞的有氧糖酵解

研究者观察到MYBPC3-KO成纤维细胞培养液和细胞裂解液中的葡萄糖浓度下降，而乳酸水平上升且比成纤维细胞更快(图4A-D)。MYBPC3-KO成纤维细胞的ATP产量也升高(图4E)。此外，与野生型对照相比，MYBPC3-KO成纤维细胞中参与糖酵解的关键酶GCK、PFKM和LDHA的转录和翻译水平均显著增加(图4F-H)。

使用葡萄糖模拟物2deoxy-d-glycose (2-DG)抑制糖酵解显著降低糖酵解基因和纤维化标志基因(COL1A1和a-SMA)的表达，但对TGF-B1的表达没有影响(图4F-H)。

图4

这些结果表明，Mybpc3基因的丢失会导致成纤维细胞代谢重编程。

Mybpc3缺失可通过NF-KB信号通路

研究者检测了WT和MYBPC3-KO成纤维细胞中的NF-KB信号通路。在MYBPC3-KO成纤维细胞中，磷酸化的p65是NF-kB活性的指标，而TGF-B1抑制剂SB-431542不影响NF-kB信号通路的激活(图6A&B)。NF-kB在控制促炎细胞因子的表达中起着关键作用。

图6

研究者发现MYBPC3-KO成纤维细胞培养液和细胞裂解液中CCL2、IL-1ß、IL-6和TNF-a的水平均显著升高，而NF-KB信号通路抑制剂PDTC显著抑制MYBPC3-KO成纤维细胞(图6C-F). PDTC也显著降低了TGF-B1和HIF-1a的表达(图6G)，这表示是NF-KB的下游信号，这些结果表明，Mybpc3缺陷在成纤维细胞中触发了nf - kb介导的信号级联，以驱动它们的激活。

讨论

本研究通过CRISPR/Cas9基因编辑技术构建MYBPC3突变猪HCM模型，使得MYBPC3突变猪出现了早产儿MF，MYBPC3等肌丝蛋白在原代心脏成纤维细胞和NIH3T3成纤维细胞中表达。

研究者的结果揭示了一种新的成纤维细胞内在机制，该机制通过TGF-B1、HIF-1a和有氧糖酵解，将MYBPC3缺陷与nf - kb介导的信号级联激活联系起来，从而促进HCM中过早MF的发展(图7)。

图7

在本研究中，研究者证明MYBPC3基因突变激活NF-KB信号通路。NF-KB是调控TGF-B1水平的关键分子，在肝巨噬细胞中，NF-KB与TGF-B/Smad之间可能存在串扰机制。

研究表明，MYBPC3的突变增强了HIF-1a的表达和有氧糖酵解。研究者证明了TGF-B1可以增强MYBPC3-KO成纤维细胞中HIF-1a的表达，而SB-431542可以逆转这种表达。不仅在R495Q突变猪中观察到代谢从氧化磷酸化转变为有氧糖酵解(Warburg效应)和乳酸产量的增加，在MYBPC3-KO成纤维细胞中也观察到，这可以通过有氧糖酵解抑制剂2-DG逆转。

总之，心肌成纤维细胞中MYBPC3的缺乏可以通过NF-KB/TGF-B1/HIF-1a/有氧糖酵解信号级联促进其向肌成纤维细胞转分化，导致心肌过早纤维化。这些发现强调了在未来MYBPC3突变的HCM患者的治疗发展中，将心脏成纤维细胞作为额外治疗靶点的重要性。

文献参考：

DOI: https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-1724020/v1

---------------------------------------------------

艾菱菲生物可提供实验用猪、配套整体实验服务。

巴马小型猪、克隆定制猪；清洁级、SPF级都有售，常规月龄现货，价格实惠，全国地区送货上门，欢迎咨询订购！

更多专业、有趣的科研知识，尽在艾菱菲生物！

---------------------------------------------------

主办 | 艾菱菲市场营销部

监制 | 太阳风

总编 | 柠檬

投稿 | 亚伦