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文献解读 | 急性肾损伤小鼠空间转录组测序分析

发布时间：

2022-12-16 13:55

导读：

急性肾损伤（Acute Kidney Injury,AKI）：指突发(1-7d内)和持续(>24h)的肾功能突然下降，血清肌酐（SCr）至少上升0.5mg/dl 1，表现为氮质血症、水电解质和酸碱平衡，伴有少尿（<400ml/24h或17ml/h）或无尿（<100ml/24h），以及各系统症状。

单核RNA测序(snRNA-seq)揭示了AKI损伤诱导的细胞状态和基因表达模式，而无法解释细胞间通信网络和区域基因表达的模式。研究者使用空间转录组测序技术进行探索。

单细胞测序技术影响了研究人员研究肾细胞生物学和疾病的方式。最近单核RNA测序(snRNA-seq)揭示了AKI损伤诱导的细胞状态和基因表达模式。这项工作描述了损伤的近端小管细胞状态，可以进一步分为严重和失败的修复损伤。

由于组织分离，单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术无法获得空间信息，肾脏损伤后巨噬细胞和白细胞募集到损伤细胞的生理背景尚不清楚。基于这个原因，研究者应用空间转录组学测序绘制AKI修复过程中的转录变化。绝大多数小鼠AKI研究都使用了雄性小鼠，因为它们更容易发生双侧缺血再灌注损伤(IRI)，但这对雌性AKI的认识研究比较少。

研究者优化了C57BL6/J雌性小鼠与雄性小鼠产生同等损伤的时间，使用10x Genomics的Visium空间转录组，并使用分析工具SPOTlight和Giotto来提高分辨率。改进了上皮细胞和损伤细胞类型的可视化。该空间转录组图谱的生成是雌性AKI基因表达空间重建的第一步，并为AKI的多组学和空间转录组学研究提供参考。

实验流程

采用8- 10周龄的C57BL6/J雌性小鼠，自由进食和饮水。进行IRI造模，测量BUN和肌酐、肾小球滤过率(GFR)测量、PCR测定、免疫组化和免疫荧光。

实验结果

雌性C57Bl6/J小鼠IRI模型的重建

研究者对8- 10周大的雄性和雌性小鼠进行了肾损伤操作，发现雌性小鼠双侧肾蒂钳夹时间为34分钟，其损伤程度与雄性小鼠的22分钟相当。研究者分别在急性早期(4小时、12小时)、急性(2天)和晚期(6周)时间点采集组织(图1A)。

在每个时间点，研究者收集血浆测量尿素氮，并评估伤后12小时血浆肌酐和GFR(图1A)。雄性(n=4-6 /每个时间点)和雌性(n=4-6 /每个时间点)的BUN测量在整个时间过程中具有可比性，除了术后2天雌性BUN水平有统计学意义的显著下降(P=0.028)(图1B)。

损伤12小时后，雄性和雌性的血浆肌酐也显著增加(图1C)。研究者再次确认，在12小时的时间点，雄性22分钟钳夹和雌性34分钟钳夹会导致类似的肾功能下降(图1D)。研究者还使用实时荧光定量PCR (quantitative real-time PCR)检测了已知损伤标志物的转录诱导(图1E)。

正如预期的那样，在急性早期(12小时)和急性(2天)时间点，Havcr1(肾损伤标志物1 [Kim-1])和Lcn2(中性粒细胞明胶酶相关脂蛋白[Ngal])相应增加，所有损伤标志物在伤后6周恢复到伤前表达水平。

图1：建立雌性IRI小鼠肾损伤模型

(A)8- 10周龄C57BL6/J雄性(蓝色圆圈)和雌性(红色正方形)小鼠组织收集的Bi-IRI和时间轴示意图。

(B)损伤后4小时、12小时、2天和6周，雄性和雌性的BUN水平。

(C)雄性和雌性对照和12小时Bi-IRI小鼠的肌酐水平。

(D)雄性和雌性对照和12小时Bi-IRI小鼠中雌性GFR测量和GFR定量的代表性痕迹。

(E)实时荧光定量PCR检测Kim-1 (Havcr1)和Ngal (Lcn2)在雌性Bi-IRI时间进程中的肾脏表达变化

病理检测

研究者使用Seurat可视化标记基因表达，观察到近端小管(Lrp2)和收集管(Aqp2)(图2A)。然而，Visium管道的分辨率相对较低(图2A)。研究者使用免疫荧光验证了这些细胞类型的表达模式，以展示分辨率的对比，标记物对单个小管的特异性，以及研究者在SrT中最终目标的分辨率标准(图2B)。

因此，为了验证性别特异性基因表达差异和细胞类型相似性的检测，研究者将来自雄性假手术肾的SrT样本与研究者的雌性假手术肾的SrT样本进行比较，检测到可比较的主要肾细胞类型(图2C)。

图2

(A)使用Seurat对雌性皮质(Lrp2)、髓质(Aqp2)和肾小球(Nphs1)区域标记物表达的SrT表征。

(B)雌性术皮层、髓质和肾小球的广角免疫荧光图像。在雄性假肾(蓝色)和雌性假肾细胞类型聚集的UMAPs比例线为500mm .

(C)显示Seurat现有细胞类型的相似性。

利用开源工具箱解析细胞类型和基因的空间表达模式

研究者通过使用Giotto来增加计算分辨率，可以确定几种模式的基因表达变化在损伤和修复。

图3：利用Giotto解析细胞类型与基因表达的空间关系

(A)Leiden聚类UMAP和可视化雌性假手术PAGE富集。

(B)使用PAGE富集足细胞(Pod)、近端小管1-2段(PTs1-2)、连接小管(CNT)、粗升肢(TAL)和细肢(TL)的方法，在雌性假手术中主要细胞类型分辨率增加的空间图。

(C)来自PTs3 (Aadat)、TAL (Lcn2)、成纤维细胞(Cfh)和收集管(Cryab)的DEGs在雌性损伤过程中的空间表达。

研究者使用SPOTlight揭示Bi-IRI时间过程中细胞类型相互作用的变化

图4

(A)在雌性假手术中，使用snRNA-seq进行SPOTlight反褶化后，皮层、外髓质(OM)和乳头的孤立Visium区域的表现。

(B)SPOTlight反褶化后每个时间点(假手术，4小时，12小时，2天，6周)产生的对损伤敏感的细胞类型的空间相互作用图。

(C)损伤后6周，残留的组织覆盖点表达巨噬细胞标志物。

(D)巨噬细胞标记物F4/80(绿色)和InjPT标记物Kim-1(红色)在损伤时间过程中的代表性免疫荧光图像(假手术，12小时和6周)。

讨论

SCRNA-seq和snRNA-seq技术帮助研究者了解健康状态和疾病状态下的肾脏细胞类型与状态，但这些研究缺乏空间信息。研究者通过雌性Bi-IRI模型与雄性小鼠的同等损伤量进行比对，生成了肾损伤的SrT图谱，并通过Giotto和SPOTlight这两个开源工具箱，成功分析出更高分辨率的数据。

文献参考：doi.org/10.1681/ASN.2021081150

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总编 | 柠檬

投稿 | 亚伦

编审 | 小燕子

编辑 | 柠檬

文献解读 | 急性肾损伤小鼠空间转录组测序分析

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