导读
上一期我们解读了APOE4小鼠对于AD疾病的研究进展，而最近又有颠覆性文章出现，进一步表示AD疾病的致病机理另有原因，本期带大家一同解读。
大家都知道，业内关于阿尔兹海默症（AD）的主要发病机制是β淀粉样蛋白沉积（也称作老年斑）。今年6月2日，一篇名为“Faulty autolysosome acidification in Alzheimer’s disease mouse models induces autophagic build-up of Aβ in neurons, yielding senile plaques”的文章激起了水花，文章表示AD疾病的治病因素或许不只是β淀粉样蛋白。
研究者表示：AD疾病的起因是神经细胞自噬溶酶体的酸化功能发生了障碍。
自噬是溶酶体（LYs）降解的主要途径，它在疾病和细胞应激诱导下消除异常蛋白、聚集物和受损细胞器。在主要的自噬-溶酶体途径（ALP）中会形成自噬体（AP），APs与LY或者内溶酶体融合后成为自噬溶酶体（ALs）。
溶酶体内有许多种酶，如：各种组织蛋白酶、其他酸水解酶、vATPase，其中vATPase是AL管腔酸化并激活的水解酶的质子泵。
因此，当溶酶体的酸化发生障碍，自噬就会出现问题，许多需要消除的蛋白就会堆积，而堆积中的蛋白就包含β淀粉样蛋白及该蛋白的前体蛋白。
当无法分解的蛋白堆积越来越多，直到溶酶体破裂时，溶酶体内的多种水解酶及堆积蛋白就会全部流进细胞质，直到细胞膜也破裂，最终脑内就会出现大片的沉积蛋白，这些蛋白就是大脑扫描图像中呈现的淀粉样斑块。有人将淀粉样斑块形容为神经细胞与β淀粉样蛋白的遗骸。
为了识别和检测AD小鼠中的ALP缺陷，研究者使用AD模型小鼠，并使用具有神经元特异性表达的串联荧光标记（Thy-1 mRFP-eGFP- LC3，使用TRGL小鼠），发现在所有的5个AD模型小鼠中，在细胞外β淀粉样蛋白沉积之前，神经元群体中就出现了vATPase活性不足、自噬功能障碍等现象。
研究者用红绿色串联荧光标记神经细胞中的自噬体，用蓝色荧光标记溶酶体；最开始的自噬体为黄色荧光（红绿色荧光融合状态），自噬体与溶酶体融合成熟后，在溶酶体的酸性环境、蓝色荧光的影响下，荧光颜色由黄色变为红色最终变为紫色荧光。
当溶酶体的酸化功能出现障碍、酶活性不足时，融合后的荧光颜色将不会出现变红再变紫的现象，而是变成白色荧光。（图1）
通过这些颜色对比就能够清楚的检测到小鼠体内的ALP功能详细的变化。
研究者将TRGL小鼠与Tg2576小鼠（一种AD模型）杂交，得到的F1代小鼠从10-12月龄开始形成β淀粉样斑块。1.6月龄Tg2576/TRGL杂交株的ALP模式与单TRGL杂交株的ALP模式难以区分(扩展数据图1a);然而，到5月龄时，超过90%的新皮层III-V层周核除了酸化的ALs外，还获得了黄色荧光AVs(扩展数据图1a)。这表明脑部出现淀粉样斑块的时间早了至少5个月。
拓展图1a
研究者在另外两种AD小鼠模型——5xFAD小鼠的大脑中发现vATPase酶活性同样降低（拓展图1d），且时间更早。
拓展1d
在AD中，APP-βCTF和Aβ先在细胞内积累，然后β-淀粉样蛋白沉积在细胞外。到5个月时，Tg2576/TRGL小鼠III-V层新皮层周核中40%含有Aβ/APP-β ctf阳性斑点(图3a)，根据CTSD联合免疫标记和4个荧光团成像(图3a，箭头和图3b)，这些斑点几乎全部为pa-AL(88.6±2.4%)。
在10个月大的Tg2576/TRGL小鼠中，新皮层神经元亚群(III-V层)开始大量积累增大的pa-ALs，使质膜向外膨胀(图4a）。大部分受累核周的AVs经IHF检测为ly -标记阳性，提示为pa-ALs(图4d和扩展数据3b)，这反映了AL成熟和酸化的严重缺陷。
在五种不同的AD小鼠模型中观察到相同的自噬神经退行性模式，包括神经病理发病加速的模型(5xFAD, TgCRND8和PSAPP)或发病延迟的模型(Tg2576和app51 -一种表达hAPPwt的异常晚发模型)(图5，4 e)。5xFAD/TRGL小鼠在早期(根据性别在2个月后开始)就出现了健壮的ALP破坏和神经元变性(扩展数据图3 - e)
通过共聚焦成像，看到充满自噬液泡（AV）直接从PANTHOS神经元的核周细胞质通过向核周中心锥形的颈向外延伸(图5a)，形成花冠样式的结构，这样的神经元被称为“毒花神经元”
图5a
在5xFAD/TRGL小鼠中，在β-淀粉样斑块出现之前，a β和APP-βCTF选择性地在pa-ALs中积累(图6a)。神经元向PANTHOS模式的转变伴随着核周a β/APP-βCTF免疫反应性的稳定增加。用DAPI和抗-β-淀粉样抗体(4G8)联合标记这些PANTHOS神经元，发现在最受影响的周核中心有一个4G8阳性的电晕，周围环绕着一个DAPI阳性的核残体(图6b)。
在PANTHOS的较晚期，随着更多β-淀粉样蛋白在中心积聚，DAPI荧光逐渐消失(扩展数据图6d)
此外，在2.7月龄的5xFAD/TRGL小鼠的皮层PANTHOS病变中，91.4±1.29% (n=6，每只小鼠2个切片)检测到dapi阳性核信号，包括核周中心的凝聚或碎片化/弥漫信号(图7c)。在老龄小鼠(6个月)中，尽管胶质细胞浸润和神经退行性变严重，67.8%的PANTHOS神经元仍显示DAPI核信号(图7d)。这个百分比可能被低估了，因为用核标记KDM1/LSD1进行的免疫电镜分析显示，即使在核完整性丧失后也能发现核残留。
图7
从完整的有核PANTHOS神经元过渡到DAPI消失的更高级阶段，伴随着胶质细胞的入侵，可能代表细胞完整性的丧失和转化为细胞外斑块。
与WT同胎小鼠相比，6个月大的5xFAD小鼠的胞质和膜/囊泡分离分析显著增加了大脑胞质中溶酶体酶的水平(图7e)。溶酶体酶泄漏在6个月大的大脑中检测到，但在幼龄(2.7个月)的大脑中检测不到，此时受影响的神经元较少。
为了描述PANTHOS神经元病变向成熟斑块的演变过程，我们用硫黄素S (Thio-S)对PANTHOS进行免疫标记，用于检测致密核老年斑(图8a和扩展数据图7b,c)。在2.2月龄时的5xFAD/TRGL定量分析中，半数PANTHOS基因图谱为硫代s阳性，而在6月龄的5xFAD/TRGL小鼠中，超过95%为硫代s阳性(图8a，图表)。
在老年5xFAD小鼠中，当相邻的PANTHOS神经元合并成一个更大的结构(分别为图8c、A1和A2)，包含多个硫代- s阳性致密核(图8d)时，PANTHOS病变经常扩大为更大的老年斑。在这些不断增长的病变中，新募集的PANTHOS神经元仍然可以被识别(扩展数据图8a，箭头)，但原始PANTHOS神经元及其邻近邻近神经元完整性的丧失，随着其他细胞碎片的清除，形成了一个持续存在β-淀粉样蛋白的中央核心，最终形成了一个扩大的细胞外致密核老老斑(分别为图8b、A3和A4)。
在研究五种不同AD模型中形成的斑块中，PANTHOS神经元在数量上占绝大多数。PANTHOS神经元的后续小胶质细胞和星形细胞侵袭预示着最终的细胞死亡，将完整神经元内的淀粉样病变转化为细胞外淀粉样斑块。
AD中的β-淀粉样斑块形成通常被认为源于分泌的Aβ衍生的β-淀粉样蛋白的细胞外沉积，然后引发继发性神经营养不良和神经元细胞死亡。
相比之下，研究者在不同AD模型中的证实：细胞外斑块主要由膜小管内β-淀粉样蛋白的神经元内积累演变而来，在单个完整的PANTHOS神经元中形成集中的淀粉样蛋白“核心”，随后退化形成经典老年斑。这种“由内而外”的过程符合并证实了许多研究者的假设。
这个研究结果证明，溶酶体酸化功能障碍是与神经退行性疾病相关的遗传和代谢紊乱致病原因。
研究者的证据表明，AD模型中的PANTHOS级联可以通过靶向溶酶体pH值缺陷的药理学方法显著缓解。
文献参考：
https://doi.org/10.1038/s41593-022-01084-8
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主办 | 艾菱菲市场营销部
监制 | 太阳风
总编 | 柠檬
编审 | 小燕子
编辑 | 柠檬
