文献解读|皮肤移植和树突状细胞“增强”的人源化小鼠模型在治疗性癌症疫苗的临床前评估
发布时间：
2024-06-24 15:37
疫苗是人类历史上最成功的医学进步之一，有广泛应用的乙肝病毒、人乳头瘤病毒（HPV）和严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型疫苗的显著例子。能够重现疾病特征并预测人类反应的更好的临床前小鼠模型对于克服当前癌症疫苗有限的免疫原性和效力至关重要，从而提高其临床适用性和疗效。
在这些模型中，植入人类免疫细胞并携带人类或类人类肿瘤的人源化小鼠是一种有价值的工具。而在参与免疫应答的免疫细胞中，树突细胞（Dendritic cell）是目前已知的功能最强的抗原递呈细胞，在不远的未来将成为攻克癌症的又一把利剑。
本文作者通过探索HLA匹配在NSG系统、用于植入的人外周血单核细胞PBMC来源和DC互补策略中的影响，开发了两种新的人源化小鼠模型，以评估靶向人乳头瘤病毒（HPV16）抗原和将肿瘤抗原递送到人CD141+树突状细胞（DC）的疫苗的免疫原性和治疗效果。适用于表征靶向发育不良皮肤表达的HPV抗原或在体内向人类Clec9A+DC递送不同肿瘤抗原的疫苗的免疫原性和治疗效果。
研究结果
结果1：NSG-A2小鼠在移植PBMCs后的免疫情况
移植两周后，新鲜的PBMC，人源免疫细胞比例比冷冻后PBMC从20%提高到80%;
移植28天后血液保持70%以上，脾脏提高有后置性，从第一周的20%提高到80%，外周血pbmc逐渐定植周围器官和/或器官中某些群体的被动扩增。
骨髓细胞（CD11b+）、DN细胞、NK和NKT细胞在脾脏和血液中丰度下降；B细胞在血液中下降，但在脾脏中增加；
T细胞占比最大，CD4+ T跟供体相比保持一致，但CD8+ T明显高于供体；双阳性T细胞丰富度随着时间的推移而增加，这与移植物抗宿主病(GvHD)的发病有关
使用antiCD3/anti-CD28 antibody的磁珠刺激移植21天后的脾脏细胞，通过流式细胞术测量IFNγ的细胞内积累，测试响应效果；
CD4+和CD8+T细胞亚群都表达高水平的效应细胞因子，证明了它们在移植后21天内对T细胞受体介导的刺激有反应的能力。
结论：
结果2：人源化小鼠皮肤移植模型及其对DNA-HPV治疗性疫苗的反应
作者首先构建人源化小鼠皮肤移植模型
杂交后，F1代NSG-A2_K14E7皮肤表皮的特征性增厚；
对F1 NSG-A2_B6/K14E7供体进行致命照射，将F1的耳朵上的皮肤移植到NSG-A2受体小鼠，完全愈合后，给与PBMC移植；
PBMC移植前后，没有出现排斥反应，小鼠体重没有明显下降，表示没有移植物抗宿主病（GVHD）。
术后2个月，NSG-A2-K14E7上皮增生明显高于NSG-A2-B6；
脾脏和皮肤都有很多人免疫细胞hCD45+，通过免疫荧光分析，其中大部分都是浸润的T细胞（CD3+）；
测试HPV治疗性疫苗
只有NSG-A2_K14E7移植物对第一次和第二次HPV疫苗接种迅速反应，移植物的初始面积显著减少；
用E7肽进行离体时，仅在从接种了HPV疫苗的动物的脾脏中分离的CD4+和CD8+人T细胞中观察到IFNγ的表达
结论：
K14E7转基因小鼠和NSG-A2杂交后的F1代皮肤表皮的特征性增厚，F1代皮肤移植到NSG-A2小鼠身上，再注射人PBMC，可以构建人免疫细胞浸润的人源化小鼠皮肤移植模型。
模型接种疫苗后，NSG-A2_K14E7移植物的初始面积显著减少。取接种之后的脾脏组织，E7肽段进行再次免疫，只有在NSG-A2_K14E7-疫苗组中人T细胞中观察到IFNγ的表达，接种抗肿瘤疫苗后，表现出人类免疫系统能够产生抗原特异性反应。
此模型可以有效评价人源化小鼠皮肤移植模型对DNA-HPV治疗性疫苗的反应。
结果3：用Flt3-L处理的PBMC增强PBMC-hu-NSG-A2小鼠免疫，增加人CD141+cDC1细胞的数量并增强抗原特异性T细胞反应
体外Flt3-L孵育PBMC在24h增加了DC细胞的含量，但是在48h出现下降，因此选择24小时处理进行后续实验；
在终点（第17天）进行的分析表明，人CD141+DC的可检测部分能够摄取F-肌动蛋白-TNE，并被NY-ESO-1表位特异性激活。
d21收集来自人源化小鼠的脾脏，并用NY-ESO-1表位体外再刺激含有人CD45+淋巴细胞的总脾细胞，疫苗+FLT3L的效应更强，观察到表达一种或两种细胞因子的表位特异性CD8+T细胞数量显著更高。
摸索了多次小剂量和大剂量注射PBMC细胞，发现都没有出现体重减轻，可能是延迟了GvHD的发作，2×106PBMC表现出CD45+细胞移植的效率显著更高。
结论：治疗疫苗的开发需要足够的DC细胞
结果4：PBMC-hu-NSG和PBMC-hu-NSG-A2模型的直接比较支持使用HLA匹配系统测试癌症疫苗
疫苗接种后两种小鼠免疫细胞的差异
两种小鼠品系中诱导的表位特异性T细胞反应的总体程度相似；
PBMC-hu-NSG-A2小鼠中观察到稍微但显著更高数量的单功能CD8+T细胞反应。
疫苗接种后两种小鼠对MDA-MB-231的影响
未接种疫苗（对照）和接种疫苗（TNE）的MDA-MB-231-携带PBMC的hu-NSG小鼠在PBMC注射后第24天开始出现GvHD的迹象，,PBMC-hu-NSG-A2小鼠在PBMC植入后6周内均未显示出GvHD的证据，在没有出现GvHD迹象的30天，疫苗接种在PBMC-hu-NSG-A2小鼠中导致显著的MDA-MB-231肿瘤生长抑制。
疫苗接种后小鼠对黑色素瘤A375 的影响
由图可以看出疫苗接种后能够显著抑制肿瘤的生长，直到40天没有出现GvHD现象，未接种疫苗的小鼠中都保留了高水平的CD45+细胞；
第40天收集脾脏，在用肿瘤相关表位库体外刺激6小时和细胞内细胞因子染色后，通过流式细胞术测量脾脏CD8+和CD4+T细胞中的细胞因子产生。
结论：
NSG和NSG-A2小鼠移植PBMC和接种疫苗后，T细胞响应总体一致，PBMC-hu-NSG-A2中CD8+T的响应略微好一些PBMC-hu-NSG和PBMC-hu-NSG-A2接种MDA-MB-231后，NSG在24天时出现GvHD，PBMC-hu-NSG-A2，接种疫苗后显著抑制MDA-MB-231肿瘤生长PBMC-hu-NSG-A2，接种疫苗后显著抑制A375 肿瘤生长，体外验证淋巴细胞效应，细胞因子产生显著提高。
尽管不断取得进展，人类癌症疫苗的最佳抗原制剂的选择仍然是一个挑战，需要合适的临床前模型来研究新的人类肿瘤抗原的免疫原性，并在功能上表征体内引发的CD4+和CD8+T细胞反应。这些模型为评估靶向HPV16发育异常皮肤和特异性递送至CD141+DC的多种肿瘤抗原的治疗性癌症疫苗的效力提供了有价值的平台。
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