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精准靶向！AAV病毒小鼠肾脏原位注射，成体基因编辑“指哪打哪”！

发布时间：

2025-04-22 10:03

肾脏作为泌尿系统的核心器官，由20余种细胞类型构成复杂功能单元，包括肾小体（含内皮细胞、足细胞、系膜细胞）和肾小管（上皮细胞为主）。其独特的生理屏障（如肾小球基底膜狭缝孔径仅10nm）使得系统性给药的腺相关病毒（AAV）难以有效渗透，约90%的病毒颗粒会被肝脏捕获，导致肾脏靶向效率低下。

因此，针对不同组织和不同细胞选择合适的血清型、特异性启动子和注射方式有效提高AAV的感染效率。

肾脏—AAV注射指南

| 合适的血清型

AAV8和AAV9型对肾脏不同细胞都具有较好的感染效果，主要以AAV9为主。

| 特异性启动子

可以选择广谱性启动子CMV，也可以针对不同细胞选择相应的特异性启动子以获得最佳感染效果，如感染肾脏足细胞可选择Nphs1、Nphs2，感染肾小管上皮细胞可使用Ksp-cadherin、SGLT2等。

| 注射方法：

系统性给药（尾静脉注射）感染肾脏的效果较差，因此我们可以选择多种肾脏局部注射的方法，包括肾动脉注射、肾静脉逆行注射、输尿管逆行注射、肾实质注射和肾盂注射的方式来增强病毒感染效率。

图1. 肾脏局部注射方法。A.肾动脉注射；B.肾静脉逆行注射；C.输尿管逆行注射 D.肾实质注射：根据针的插入深度，注射进入肾皮质或髓质。来源：Rubin, J.D. and M.A. Barry. Mol Diagn Ther, 2020

表1. 不同肾脏注射方法的感染范围和病毒剂量汇总

① 肾动脉注射

实验材料：

① 手术器械：剃毛刀、手术垫、直头镊、弯头镊、手术剪、胰岛素注射器、5-0 可吸收线缝合针、棉签棒、70%酒精棉球、明胶海绵、组织胶

② 试剂：PBS，生理盐水，麻醉剂，碘伏。

手术操作：

1、取出已被麻醉的大鼠，置于手术垫上。使用碘伏擦拭小鼠肾脏区域皮肤，待碘酒吸收入皮肤后，70%酒精棉球擦去碘伏。

2、将肾脏区域皮肤（肾区）做一切口2-3cm，剪开大鼠的皮肤，分离皮肤暴露出肌肉层。

3、用棉签将脏器抵住，暴露肾脏及肾脏周围血管，分离出肾动脉血管，将远端用血管夹夹住，弯镊勾出动脉血管，胰岛素注射器刺入血管进行注射（50微升左右）。

4、注射完成后，在拔出注射针的同时，将准备好的明胶海绵按压在血管破口处，并用组织胶粘连，后取下止血夹，拿出抵住脏器的棉签，缝合。

操作要点：

01 确保精准穿刺主动脉并推进导管至肾动脉，穿刺操作不当可能损伤肾动脉壁（如血管破裂或微小动脉瘤），造成病毒载体外渗至周围组织，降低靶向递送效率。

02 注意注射速度，快速注射可能损伤病毒，降低其感染活性；同时高压可能导致血管内皮细胞机械性损伤，引发局部炎症反应。

② 肾静脉注射

实验材料：

① 手术器械：剃毛刀、手术垫、直头镊、弯头镊、手术剪、胰岛素注射器、5-0 可吸收线缝合针、棉签棒、70%酒精棉球、明胶海绵、组织胶。

② 试剂：PBS，生理盐水，麻醉剂，碘伏。

手术操作：

1、适应性喂养后，大鼠麻醉后仰卧位固定于手术台上，腹部备皮后常规消毒皮肤。

2、将肾脏区域皮肤（肾区）做一切口2-3cm，剪开大鼠的皮肤，分离皮肤暴露出肌肉层。

4、注射完成后，在拔出注射针的同时，将准备好的明胶海绵按压在血管破口处，并用组织胶粘连，后取下止血夹，拿出抵住脏器的棉签，缝合。

操作要点：

01 确保止血夹完全阻断远端血流，若肾静脉远端未有效夹闭，病毒液可能逆流至周围血管或组织，降低靶向效率‌。

02 控制刺入深度‌，注射针斜面朝上平行刺入静脉腔，注射时观察无阻力且局部无肿胀针头过浅（未完全进入静脉腔）或过深（穿透血管壁），导致病毒液外渗至肾周组织‌。

③ 肾实质注射

实验材料：

① 手术器械：剃毛刀、手术垫、直头镊、弯头镊、手术剪、5-0 可吸收线缝合针、棉签棒、70%酒精棉球、胰岛素注射器或30G针头。

② 试剂：PBS、生理盐水、麻醉剂、碘伏。

手术操作：

1、取出已被麻醉的小鼠，置于手术垫上。使用碘伏擦拭小鼠肾脏区域皮肤，待碘酒吸收入皮肤后，70%酒精棉球擦去碘伏。

2、用镊子夹起左侧皮肤，用手术剪在消毒区域剪开一个 1cm 左右的创口，分离皮肤暴露出肌肉层。用拇指和食指轻轻挤出肾脏，可将肾脏部位脂肪拨开。

3、暴露出肾脏后，将浸过PBS纱布覆盖肾脏表面保湿。

4、将带有30G针头的注射器刺入肾实质中进行注射（2微升左右），一般注射深度2-3mm左右，注射完成后拔出注射器，用棉签按压2-3分钟后，肾脏不出血即可放回腹腔（或用组织胶粘连伤口处）。用缝合线缝合肌肉层和外皮。

操作要点：

01 注射深度控制在1.5-2 mm（小鼠肾脏厚度约3-4 mm），针头刺入过深可能穿透肾被膜，导致病毒液外渗至肾周组织或尿路；刺入过浅则无法将AAV递送至肾小管或肾小球靶区。

02 注射时注意压力与速度，注射后棉签原位轻压1-2分钟，防止病毒液反流。

④ 肾盂注射

实验材料：

① 手术器械：剃毛刀、手术垫、直头镊、弯头镊、手术剪、5-0 可吸收线缝合针、棉签棒、70%酒精棉球、胰岛素注射器或30G针头。

② 试剂：PBS、生理盐水、麻醉剂、碘伏。

手术操作：

1、取出已被麻醉的大鼠，置于手术垫上。使用碘伏擦拭大鼠肾脏区域皮肤，待碘酒吸收入皮肤后，70%酒精棉球擦去碘伏。

3、暴露出肾脏后，将浸过PBS纱布覆盖肾脏表面保湿。

4、将带有30G针头的注射器刺入肾盂中进行注射（50微升左右），一般注射深度2-3mm左右，注射完成后拔出注射器，用棉签按压2-3分钟后，不出血即可放回腹腔（或用组织胶粘连伤口处）。用缝合线缝合肌肉层和外皮。

操作要点：

01 确保注射位置，肾盂体积小（小鼠肾盂仅约1-3mm³），若注射针头未精准刺入肾盂腔，可能导致病毒悬液外溢至肾实质或周围组织，降低靶向效率。

02 注意注射压力或速度。压力过高可能引发肾盂破裂或病毒反流入输尿管甚至膀胱。速度过快可能使液体未充分扩散即被尿液稀释，导致AAV分布不均。

⑤ 输尿管逆行注射

实验材料：

① 手术器械：剃毛刀、手术垫、直头镊、弯头镊、手术剪、5-0 可吸收线缝合针、棉签棒、70%酒精棉球、胰岛素注射器或30G针头（或32G）。

② 试剂：PBS、生理盐水、麻醉剂、碘伏。

手术操作：

1、取出已被麻醉的大鼠，置于手术垫上。使用碘伏擦拭大鼠下腹皮肤，待碘酒吸收入皮肤后，70%酒精棉球擦去碘伏。

2、手术切口：在麻醉状态下，进行腹部切口，暴露腹腔。

3、识别输尿管：小心拨开肠管，识别并暴露右侧或左侧输尿管，并用棉签或镊子分离输尿管上的脂肪等。

4、输尿管注射：在选定的输尿管远端用止血夹夹住，弯镊勾住输尿管，带有30G针头的注射器刺入输尿管中进行注射（20-30微升左右）。

5、注射完成后，拔出注射器，用另一个止血夹在破口上方夹闭，5分钟后，取下上下方血管夹，输尿管放回腹腔。缝合线缝合肌肉层和外皮。

操作要点：

01注意注射角度30-45°角刺入输尿管管壁，确保针头斜面贴合管腔无泄漏‌，针头刺入角度偏离输尿管轴线或深度不足，会导致病毒液外渗至周围组织或未能有效逆行灌注肾盂区域‌。

02注意注射角度30-45°角刺入输尿管管壁，确保针头斜面贴合管腔无泄漏‌，针头刺入角度偏离输尿管轴线或深度不足，会导致病毒液外渗至周围组织或未能有效逆行灌注肾盂区域‌。

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